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RT-PCR試劑盒使用注意事項(xiàng)

瀏覽次數(shù):750發(fā)布日期:2021-08-06
  RT-PCR試劑盒反應(yīng)就是從RNA反轉(zhuǎn)錄至cDNA,然后通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增cDNA的過程。試劑盒采用了一步反應(yīng)法完成整個RT-PCR反應(yīng),即RNA-cDNA-PCR反應(yīng)操作在同一反應(yīng)體系中進(jìn)行,反應(yīng)過程中不需增加額外的步驟,就可完成整個RT-PCR反應(yīng),同時整個反應(yīng)系統(tǒng)且含有電泳時所需要的試劑,可直接上樣電泳。本試劑盒具有方便、簡捷、靈敏度高、重復(fù)性好的特點(diǎn),可適用于各種動、植物、病毒RNA的PCR檢測。
  RT-PCR試劑盒備注:
  1.用戶可根據(jù)自己的情況調(diào)整優(yōu)化PCR反應(yīng)擴(kuò)增參數(shù):
  ·退火溫度:可根據(jù)實(shí)際情況適當(dāng)?shù)靥岣呋蚪档屯嘶饻囟龋?0℃~65℃)。
  ·延伸時間:延伸時間因目的序列長度的不同而不同
  ·循環(huán)次數(shù):cDNA量較少時,循環(huán)次數(shù)可增加為40~50次
  ·調(diào)整鎂離子的濃度
  2.用戶可根據(jù)本試劑盒提供的β-actin引物(陽性對照)驗(yàn)證RT-PCR體系是否良好(選做):
  1.使用前每個組份輕輕混勻,然后2000rpm離心20s;
  2.取滅過菌且無核酸酶的0.2mlPCR管,依次加入。
  RT-PCR試劑盒使用注意事項(xiàng):
  1.平臺效應(yīng):PCR不能進(jìn)入平臺期,出現(xiàn)平臺效應(yīng)與所擴(kuò)增的目的基因的長度、序列、二級結(jié)構(gòu)以及目標(biāo)DNA起始的數(shù)量有關(guān)。故對于每一個目標(biāo)序列出現(xiàn)平臺效應(yīng)的循環(huán)數(shù),均應(yīng)通過單獨(dú)實(shí)驗(yàn)來確定。
  2.防止DNA的污染:①采用DNA酶處理RNA樣品;②在可能的情況下,將PCR引物置于基因的不同外顯子,以消除基因和mRNA的共線性。
  3.RNA提取試劑盒:目前試劑公司有多種RNA提取試劑盒、cDNA試劑盒、PCR試劑盒以及RT-PCR試劑盒出售,其原理基本相同,但操作步驟不一。如果使用試劑盒,具體操作步驟請參照試劑盒說明書。
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